प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के प्रकार Type
जब 1600 ई. के आसपास सूक्ष्मदर्शी का आविष्कार किया गया, तो प्राकृतिक दार्शनिकों ने अपनी आँखें एक दुनिया के भीतर की दुनिया की ओर मोड़ लीं। जब एंटनी वैन लीउवेनहोक ने दृश्य को समायोजित करने के लिए छोटे, अत्यधिक घुमावदार लेंस और एक यांत्रिक धारक तैयार किया, तो उन्होंने बैक्टीरिया, रक्त कोशिकाओं, प्रोटोजोआ और पौधों की सेलुलर संरचना की सूक्ष्म दुनिया पर एक खिड़की खोली। लेकिन माइक्रोस्कोपी के पूरे इतिहास में, हमेशा एक सवाल रहा है: लेंस के माध्यम से देखी जाने वाली ये अजीब चीजें क्या हैं? प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीकों के एक सेट को संदर्भित करता है जो उस अनिश्चितता को कम करता है - क्योंकि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में जब एक नमूने पर प्रकाश चमकता है, तो यह अपने स्वयं के प्रकाश को ठीक पीछे चमकता है।
epifluorescence
अब तक का सबसे आम फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप एपिफ्लोरेसेंस कॉन्फ़िगरेशन है। एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप में, एक प्रकाश स्रोत - आमतौर पर एक पारा या क्सीनन लैंप - एक फिल्टर के माध्यम से चमकता है जो तरंग दैर्ध्य के एक संकीर्ण क्षेत्र का चयन करता है। फ़िल्टर्ड प्रकाश माइक्रोस्कोप ऑब्जेक्टिव लेंस के माध्यम से नमूने पर चमकता है। आने वाली रोशनी फ्लोरोफोर्स द्वारा अवशोषित होती है - आणविक लेबल जो एक लंबी तरंगदैर्ध्य के प्रकाश को उत्सर्जित करते हैं जब वे कम तरंगदैर्ध्य के प्रकाश को अवशोषित करते हैं। फ्लोरोफोर्स से प्रकाश, रोशनी के स्रोत से बिखरी हुई रोशनी के साथ, ऑब्जेक्टिव लेंस और डिटेक्टर या आंख में वापस चला जाता है। रास्ते में, एक और फिल्टर रोशनी की रोशनी को रोकता है, इसलिए जो कुछ बचा है वह नमूने से फ्लोरोसेंट रोशनी है।
कोंफोकल
एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप माइक्रोस्कोप के देखने के क्षेत्र में हर जगह से प्रकाश एकत्र करता है। कुछ उत्तेजना प्रकाश माइक्रोस्कोप के फोकल प्लेन से पहले अवशोषित हो जाता है, कुछ फोकल प्लेन में और कुछ फोकल प्लेन से परे। चूंकि माइक्रोस्कोप उस सभी प्रकाश को एकत्र करता है, छवि में फोकस पर प्रकाश की एक तेज तस्वीर होगी, लेकिन इसमें अन्य क्षेत्रों से बाहर का प्रकाश भी होगा। एक confocal खुर्दबीन ठीक करता है कि माइक्रोस्कोप के रूप में एक ही विमान में एक लेजर स्पॉट को केंद्रित करके। फिर, एक पिनहोल डिटेक्टर के सामने जाता है, जहां यह माइक्रोस्कोप फोकस से नहीं आने वाले सभी प्रकाश को अवरुद्ध करता है। नमूने को स्कैन करके, वस्तु की एक साफ त्रि-आयामी छवि प्राप्त की जा सकती है।
बहु
एक फोकल माइक्रोस्कोप में संरेखण बहुत संवेदनशील है। यदि लेज़र स्पॉट, माइक्रोस्कोप का उद्देश्य, एकत्रित प्रकाशिकी और पिनहोल बंद हैं, तो माइक्रोस्कोप के प्रदर्शन में थोड़ी सी भी कमी है। एक मल्टीफ़ोटो माइक्रोस्कोप एक लेज़र वेवलेंथ का उपयोग करके इस समस्या को हल करता है जो नमूने में फ़्लोरोफ़ोर्स को उत्तेजित करने के लिए केवल आधा ऊर्जावान है। फ्लोरोफोर्स उत्तेजित होने और फ्लोरोसेंस उत्सर्जित करने का एकमात्र तरीका यह है कि यदि लेजर प्रकाश पर्याप्त उज्ज्वल है ताकि प्रकाश के दो कण - फोटॉन - बहुत कम समय में फ्लोरोफोर पर हमला कर सकें। यह तभी होता है जब लेज़र बहुत छोटे स्थान पर केंद्रित होता है। तो नमूने में एकमात्र स्थान जो प्रकाश उत्सर्जित करेगा वह है जहां लेजर केंद्रित है, जो छवि को अच्छा और साफ रखता है क्योंकि छुटकारा पाने के लिए कोई अतिरिक्त पृष्ठभूमि प्रकाश नहीं है - जिसका अर्थ है कि संरेखित करने के लिए कोई पिनहोल नहीं है।
कुल आंतरिक परावर्तन प्रतिदीप्ति (TIRF)
बहुत साफ चित्र प्राप्त करने का एक अन्य तरीका यह सुनिश्चित करना है कि उत्तेजना प्रकाश नमूने में बहुत दूर न जाए। यदि न्यूरॉन्स की एक बूँद, उदाहरण के लिए, कांच की स्लाइड पर समाधान की एक बूंद में रखी जाती है, तो कुछ न्यूरॉन्स कांच की सतह का पालन करेंगे। कुल आंतरिक परावर्तन प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोप में प्रकाश को कांच की स्लाइड में बग़ल में निर्देशित किया जाता है, इसलिए यह वास्तव में इसे कोशिकाओं को पकड़े हुए समाधान में नहीं बनाता है। लेकिन कुछ प्रकाश बस मुश्किल से घोल में रिसता है - कांच की सतह के बहुत करीब। इसका मतलब है कि प्रकाश का उत्सर्जन करने वाली एकमात्र जगह कांच की सतह के ठीक ऊपर एक बहुत पतले क्षेत्र में होगी। न्यूरॉन्स जैसी किसी चीज के लिए, जहां कोशिकाओं की सतह पर इतनी दिलचस्प चीजें होती हैं, यह तकनीक बहुत प्रभावी हो सकती है।
सुपर संकल्प
सभी सूक्ष्मदर्शी - प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी सहित - प्रकाश के प्रसार को नियंत्रित करने वाले भौतिकी द्वारा सीमित हैं। बुनियादी नियमों में से एक यह है कि प्रकाश का एक केंद्रित स्थान केवल इतना छोटा हो सकता है - और छोटा नहीं। दृश्यमान प्रकाश के लिए, वह आकार लगभग 200 नैनोमीटर या मीटर का 200 अरबवां भाग होता है। लेकिन एकल अणु आकार में केवल कुछ नैनोमीटर होते हैं, इसलिए कई दिलचस्प विशेषताएं हैं जो उस आकार सीमा से नीचे हैं, जिन्हें विवर्तन सीमा कहा जाता है। वैज्ञानिक उस सीमा के आसपास घुसने के लिए "सुपर-रिज़ॉल्यूशन" तकनीक विकसित कर रहे हैं। संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) और उत्तेजित उत्सर्जन में कमी (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी, उदाहरण के लिए, दोनों फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी विधियां हैं जो उत्तेजना प्रकाश स्थान के आकार को कम करके प्रकाश उत्सर्जक स्थान के आकार को सीमित करती हैं।
